Mengenal Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para peneliti bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip umum kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dengan bantuan enzim. Sejak ditemukan pertama kali mesin PCR (nama lainnya Thermal Cycler) oleh Karry Mullis pada tahun 1984, kini hampir semua kegiatan di bidang biologi molekuler, genetika, kedokteran hingga forensik tidak lepas dari PCR. Wajar  jika The Royal Swedish Academy of Sciences mengganjar Mullis dengan Hadiah nobel pada tahun 1993.

video lain yang bisa menjelaskan prosedur PCR menjadi lebih sederhana adalah

Prinsip kerja PCR adalah menggandakan potongan DNA tertentu dari seluruh untaian DNA, baik yang berasal dari DNA sel inti (nukleus) maupun organel sel seperti DNA mitokondria (mtDNA) atau Ribosom (rDNA). Untuk mendapat potongan DNA, diperlukan Primer yang berfungsi untuk menandai dimana ujung DNA yang akan digandakan. Primer biasanya berpasangan, yaitu Primer forward untuk menandai ujung depan untai DNA dan Primer Reverse untuk menandai dari ujung belakang. Karena DNA terdiri dari 2 untai pilinan ganda (double strand), maka DNA Primer forward bekerja pada strand yang satu sementara Primer Reverse bekerja pada untai pilinan yang satunya.

Untuk melakukan penggandaan, dibutuhkan bahan baku DNA buatan, namanya dNTP. Masih ingat 4 jenis ribosa DNA kan?  yups .... Adenine, Guanine, Cytosin dan Thymine. Nah... untuk PCR diperlukan dNTPa untuk Adenine, dNTPg, dNTPc dan dNTPt untuk masing-masing gula ribosa. Biasanya campuran dNTP-dNTP ini dalam istilah bahasa Inggris cukup disingkat dNTP's.

Untuk merakit untai DNA buatan dari dNTPs ini, dibutuhkan bantuan enzyme Taq polymerase. Enzyme ini bekerja optimal pada suhu tinggi hingga 100 derajat celcius. Taq polymerase dipanen dari sebuah bakteri bernama Thermus aquaticus yang ditemukan di sumber air panas, makanya hasil enzyme nya tahan panas dan tidak rusak pada suhu air mendidih.

Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu Denaturing, Annealing dan Extension. 

1. Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Pada tahap ini, ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-masing akan menjadi untai tunggal. Biasanya suhu Denaturing berkisar antara 92-94 derajat celcius.
   
2. Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari pasangannya di untai-untai DNA. Jika pas..... maka dia akan melekat. Suhu Annealing biasanya berkisar antara 40-55 derajat Celcius. Suhu yang biasanya umum dipakai adalah 50-52 derajat C.
   
3. Setelah itu, mesin PCR akan kembali memanaskan 'sup DNA' lagi ke suhu 72 derajat celcius agar Taq polymerase bekerja menggandakan potongan DNA. Pertama ia, maksudnya si Taq, membaca primer seperti layaknya pesawat terbang lari di landasan pacu sebelum take off. 
   

Biasanya ketiga tahap ini diulang sebanyak 30 kali untuk mendapatkan 1.073.741.766 atau satu miliar tujuh pulih tiga juta tujuh ratus empat puluh satu ribu tujuh ratus enam puluh enam  -(bener nggak bacaan ane ;-)) - kopi / clone potongan DNA.

Nah...potongan-potongan inilah yang dimanfaatkan oleh para peneliti untuk berbagai kegunaan, mulai dari deteksi penyakit, silsilah kekerabatan keluarga, meng-kloning manusia hingga membuktikan kasus kriminal.

Sebagai tambahan pengetahuan ringan seputar PCR:

-Harga mesin PCR baru pada tahun 2004 mulai dari USD 25.000 atau 230 jety untuk kurs Rp. 9200 per dollar. Hmmmm....mahal bo!!, buat beli cendol bisa pake berenang.

- Harga Taq polymerase berkisar antara 850.000 - 1 jety se-uprit (0,5 mili(liter)) . Masih lebih banyak air mata ane yang keluar saat nonton kabhie kushie kabhi gham.

- Sementara harga dNTP untuk volume yang sama (dengan Taq), harganya 2 kali lipatnya.

Dikutip dari berbagai sumber, terutama jurnal aslinya Karry Mullis.

Ekstraksi DNA Ikan dengan Metode Salting Out

Dewasa ini ekstraksi Whole DNA metode Salting Out banyak dipakai oleh para peneliti genetika di bidang ikan karena memakai garam (NaCl) dan deterjen (sodium dodecyl sulphate / SDS) yang ramah lingkungan dan tidak beracun sebagai bahan baku. 

1.  Sebelum memulai, siapkan dahulu Lysis Buffer, Proteinase K 20 mg/ml, NaCL 6 M, Isopropanol, Ethanol 70%, dan Tris-EDTA alias TE 1x. 

a. Cara membuat 20 mL Lysis Buffer, masukkan ke tabung propilen 50 ml bahan-bahan sbb:

• NaCl 0.4 M, jika stok yang tersedia 1 M, maka ambil 1,33 mL.
  
• Tris-HCl pH 8.0 
  
• EDTA 2 mM pH 8.0
  
• 20% SDS (konsentrasi akhir 2%)
  
• Air Destilasi, isi sampai total campuran mencapai 20 mL
  

b. Cara membuat 1 mL Proteinase K dengan konsentrasi 20 mg/ml, masukkan ke tabung eppendorf 1.5 mL bahan-bahan sebagai berikut:

• Proteinase K (dari pabrik biasanya bentuk bubuk) sebanyak 0.02 g
  
• CaCl2 10 uL
  
• Tris-HCl 20 uL
  
• Gliserol 500 uL
  
• Air Destilasi 470 uL
  

campurkan hingga semua bahan-bahan semuanya larut, lalu bungkus tube dengan aluminium foil. Simpan di freezer suhu -20 derajat Celcius

2. Masukkan Lysis Buffer sebanyak 400 uL kedalam tabung eppendorf 1.5 mL  dan Proteinase K 20 mg/mL sebanyak 10uL. 

3. Gunting secuil sirip ikan (1 x 1 mm), masukkan ke Lysis buffer dan hancurkan atau potong kecil-kecil sampai lembut dengan gunting kecil.

4. Inkubasi dalam waterbath suhu 55 derajat celcius selama semalam.

5. Keesokan harinya, angkat tabung eppendorf dari waterbath, tambahkan NaCl 6M sebanyak 300 uL, bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit agar larutan homogen.

6. Putar di sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 30 menit - suhu kamar.

7. Angkat, dan pindahkan supernatan (cairan yang bening) ke tabung eppendorf 1.5 mL yang baru sebanyak 450 uL dengan menggunakan micropipet . Awas....bagian keruh dari endapan jangan sampai terambil.

8. Pada supernatan, tambahkan isopropanol sebanyak 450 uL, bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit agar larutan homogen, lalu simpan di freezer suhu -20 derajat Celcius selama satu jam.

9. Setelah satu jam, masukkan ke sentrifus dan putar dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit - suhu normal.

10. Buang supernatan dengan cepat agar endapan DNA di bagian bawah tidak ikut terbuang. Lalu tambahkan Ethanol 70%. Bolak-balikkan tabung selama sekitar 1 menit sampai homogen.

11. Putar di sentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit - suhu kamar.

12. Buang supernatan dengan cepat agar endapan DNA di bagian bawah tidak ikut terbuang, lalu keringkan tabung dalam kondisi terbalik dengan tutup terbuka seperti pada gambar berikut:

13. Setelah kering (biasanya sekitar 1-1.5 jam) tambahkan TE 1x sebanyak 50 uL, lalu inkubasi ke waterbath suhu 65 derajat celcius selama 1 jam. 

Nah... Sekarang anda sudah punya DNA didalam tabung tersebut. Untuk mengecek konsentrasi DNA yang baru saja anda ekstrak / isolasi. Anda bisa menggunakan Nanodrop spektrofotometer atau melalui 1% Agarose Gel elektroforesis dengan membandingkannya dengan Lambda DNA, atau standard ladder yang telah diketahui konsentrasinya.

Nah....Akhirnya Whole DNA siap untuk dipakai. Selamat mencoba ! 

Untuk bahan bacaan lebih lanjut silahkan baca 

Aljanabi, S.M. and I. Martinez (1997). Universal and Rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acid Research 25 (22): 4692-4693.